این وضعیت موجب شد دیگِ طمع ازبک‌ها دوباره به جوش بیاید و تصمیم به غارت و تاخت و تاز در خراسان و به ویژه اطراف مشهد بگیرند. هدف اصلی مهاجمان، ورود به شهر مشهد و از دم تیغ گذراندن زائران و مجاوران و به یغما بردن نذورات و هدایایی بود که در خزانه آستان ‌قدس نگهداری می‌شد. 

پایداری مدافعان در حمله نخست
نقشه ازبکان این بود که به صورت امواج پیاپی، خراسان و به ویژه شهر مشهد را آماج حملات خود قرار دهند و به این ترتیب موجب تحلیل رفتن ساختار دفاعی شهر شوند. اوایل ماه مبارک رمضان بود که پیرمحمدخان ازبک، یکی از سرداران این طایفه که بلخ را در تصرف خود داشت با ۸هزار سوار، خودش را به مشهد رساند و شهر را محاصره کرد. نیروهای حکومتی کوشیدند از سقوط شهر جلوگیری کنند، اما این کار به سادگی امکان نداشت. اُمرای نظامی مشهد مانند صافی ولی خلیفه روملو و قنبرعلی‌خان استاجلو چاره را در بسیج نیروهای مردمی دیدند. به این ترتیب انتظامات داخل شهر تماماً در اختیار مردم قرار گرفت و نظامیان روی دفاع از باروهای مشهد متمرکز شدند. پیرمحمدخان ازبک با وجود داشتن ابزارهای قلعه‌کوبی نتوانست مدافعان شهر را که با دهان روزه به دفاع از حریم حرم مشغول بودند، به زانو درآورد. به همین دلیل پس از چند روز دست از محاصره کشید و با نیروهایش از اطراف مشهد دور شد. اما او دریافته بود که مشهد از نظر نیروهای مدافع، دچار مضیقه و تنگناست و اگر با سپاه بزرگ‌تر و ادوات نظامی بهتری به شهر هجوم بیاورند، کار یکسره خواهد شد. پیرمحمدخان این دیدگاه را با علی‌سلطان ازبک و برادرانش که به تازگی بر نساء، ابیورد و مرو تسلط پیدا کرده ‌بودند، در میان گذاشت. به این ترتیب علی‌سلطان تصمیم به یک حمله قاطع برای غارت مشهد گرفت. 

جلسه‌ای مهم در حرم‌ مطهر
نیمه ماه مبارک رمضان فرا رسیده‌ بود که خبر حرکت ازبکان به سمت مشهد، دوباره در شهر پیچید. مدافعان باز هم آماده دفاع شدند؛ اما این ‌بار قضیه فرق می‌کرد. تعداد نیروهای ازبک چند برابر هجوم قبلی بود و در این شرایط نمی‌شد به راحتی قلعه‌بانی کرد. ابراهیم میرزا صفوی، حاکم وقت مشهد جلسه‌ای با حضور فرماندهان نظامی، علما و معتمدان شهر مشهد در حرم مطهر برگزار کرد. طولی نکشید که خبر رسید ازبک‌ها خودشان را به طرق رسانده و روستاهای اطراف را به باد غارت و چپاول داده‌اند. گزارش‌ها حاکی از آن بود که تعداد نیروهای مهاجم بالاست و احتمال دارد دیوار و دروازه‌های شهر تاب مقاومت نداشته ‌باشند. در آن جلسه سرنوشت‌ساز، باید تصمیمی قاطع برای نبرد و دفاع گرفته می‌شد؛ آن هم در شرایطی که مردم از نظر آذوقه در مضیقه بودند و باید با دهان روزه به دفاع از شهر می‌پرداختند.

رودررو با دشمن
ایام، ایام شهادت امیرالمؤمنین(ع) و شب‌های قدر بود؛ ابراهیم‌میرزا پس از مدتی مشاوره و بحث تصمیم گرفت بیرون از دیوارهای شهر با ازبکان روبه‌رو شود. او می‌دانست که دست‌کم تا یک ماه آینده، امیدی به رسیدن نیروهای کمکی نیست. والی مشهد قنبرعلی‌خان استاجلو و صافی ‌ولی‌خان را برای صحبت با مردم به حرم رضوی فرستاد و آن دو، موضوع را با مردم در میان گذاشتند و از آن‌ها برای حضور در جمع مدافعان دعوت کردند. طولی نکشید که جمع زیادی از مردم روزه‌دار مشهد به جمع مدافعان پیوستند. سحرگاه روز ۲۴ رمضان پس از خوردن سحری مختصر و سپس اقامه نماز صبح، مدافعان حریم حرم از دروازه شهر خارج شده و به سوی محل استقرار ازبکان در نزدیکی طرق حرکت کردند. هنگام طلوع آفتاب، مدافعان با دشمنان غارتگر روبه‌رو شدند. جنگ بدون مقدمه آغاز و به سرعت مغلوبه شد. در آن غوغای عجیب و غریب، غریو تکبیر و فریاد «یا ثامن‌الحجج» لحظه‌ای قطع نمی‌شد. ازبکان پس از غافل‌گیری اولیه، خودشان را جمع و جور کردند و به نیروهای مدافع مشهد تاختند. مشهدی‌ها تا نزدیک اذان ظهر و با دهان روزه ایستادگی کردند و در آن گیر و دار، تعداد زیادی از آن‌ها به شهادت رسیدند؛ اما پایداری مدافعان، ازبک‌ها را به وحشت انداخت به خصوص اینکه شایع شد به زودی قوای کمکی برای مدافعان می‌رسد. این بود که علی‌سلطان ازبک و نیروهایش فرار را بر قرار ترجیح دادند. روز ۲۵ رمضان، مشهد شاهد تشییع و خاکسپاری جمعی از شهدای نبرد روز قبل بود؛ مدافعانی که مردانه جنگیدند و در آن رمضان سخت، اجازه تعرض به حریم حرم را ندادند.